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毛细管电泳概述

更新时间:2018-09-04点击次数:647次
毛细管电泳概述

毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)又叫毛细管电泳(HPCE), 是近年来发展 快的分析方法之一。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75μm内径毛细管柱内用高电压进行分离, 创立了现代毛细管电泳。1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱。1987年Hjerten 建立了毛细管等电聚焦, Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳。1988~1989年出现了初始的毛细管电泳商品仪器。短短几年内, 由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶,抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求, 得到了迅速的发展。 
CE是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。CE和液相色谱法(HPLC)相比, 其相同处在于都是分离技术, 仪器操作均可自动化, 且二者均有多种不同分离模式。二者之间的差异在于:CE用迁移时间取代HPLC中的保留时间, CE的分析时间通常不超过30min, 比HPLC速度快;对CE而言, 从理论上推得其理论塔板高度和溶质的扩散系数成正比, 对扩散系数小的生物大分子而言, 其柱效就要比HPLC高得多;CE所需样品为nl级, 低可达270fl, 流动相用量也只需几毫升, 而HPLC所需样品为μl级, 流动相则需几百毫升乃至更多;但CE仅能实现微量制备, 而HPLC可作常量制备。 
CE和普通电泳相比, 由于其采用高电场, 因此分离速度要快得多;检测器则除了未能和原子吸收及红外光谱连接以外, 其它类型检测器均已和CE实现了连接检测;一般电泳定量精度差,而CE和HPLC相近;CE操作自动化程度比普通电泳要高得多。总之, CE的优点可概括为三高二少:高灵敏度, 常用紫外检测器的检测限可达10-13~10-15mol,激光诱导荧光检测器则达10-19~10-21mol;高分辨率, 其每米理论塔板数为几十万;高者可达几百万乃至千万, 而HPLC一般为几千到几万;高速度, 快可在60s内完成, 在250s内分离10种蛋白质, 1。7min分离19种阳离子, 3min内分离30种阴离子; 样品少, 只需nl (10-9 L)级的进样量;成本低, 只需少量(几毫升)流动相和价格低廉的毛细管。由于以上优点以及分离生物大分子的能力, 使CE成为近年来发展 迅速的分离分析方法之一。当然CE还是一种正在发展中的技术, 有些理论研究和实际应用正在进行与开发。  
“CE”统指以高压电场为驱动力, 以毛细管为分离通道, 依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。其仪器结构包括一个高压电源, 一根毛细管, 一个检测器及两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。在电解质溶液中, 带电粒子在电场作用下, 以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳。 
CE所用的石英毛细管柱, 在pH>3情况下, 其内表面带负电, 和溶液接触时形成了一双电层。
在高电压作用下, 双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象叫电渗, 粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)两种速度的矢量和, 正离子的运动方向和电渗流一致, 故先流出;中性粒子的电泳流速度为“零”,故其迁移速度相当于电渗流速度;负离子的运动方向和电渗流方向相反, 但因电渗流速度一般都大于电泳流速度, 故它将在中性粒子之后流出, 从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。 
电渗是CE中推动流体前进的驱动力, 它使整个流体像一个塞子一样以均匀速度向前运动, 使整个流型呈近似扁平型的“塞式流”。它使溶质区带在毛细管内原则上不会扩张。但在HPLC中,采用的压力驱动方式使柱中流体呈抛物线型, 其中心处速度是平均速度的两倍, 导致溶质区带本身扩张, 引起柱效下降, 使其分离效率不如CE。 
理论分析表明, 增加速度是减少谱带展宽、提率的重要途径, 增加电场强度可以提高速度。但高场强导致电流增加, 引起毛细管中电解质产生焦耳热(自热)。自热将使流体在径向产生抛物线型温度分布, 即管轴中心温度要比近壁处温度高。因溶液粘度随温度升高呈指数下降, 温度梯度使介质粘度在径向产生梯度, 从而影响溶质迁移速度, 使管轴中心的溶质分子要比近管壁的分子迁移得更快, 造成谱带展宽, 柱效下降。 
一般来说温度每提高1℃, 将使淌度增加2% (所谓淌度, 即指溶质在单位时间间隔内和单位电场上移动的距离)。此外, 温度改变使溶液pH值、粘度等发生变化, 进一步导致电渗流、溶质分子的电荷分布(包括蛋白质的结构)、离子强度等的改变, 造成淌度改变、重复性变差、柱效下降等现象。降低缓冲液浓度可降低电流强度, 使温差变化减小。高离子强度缓冲液可阻止蛋白质吸附于管壁, 并可产生柱上浓度聚焦效应, 防止峰扩张, 改善峰形。减小管径在一定程度上缓解了由高电场引起的热量积聚, 但细管径使进样量减少, 造成进样、检测等技术上的困难。因此, 加快散热是减小自热引起的温差的重要途径。液体的导热系数要比空气高100倍。现在有的采用液体冷却方式的毛细管电泳仪可使用离子强度高达0.5mol/L的缓冲液进行分离, 或使用200 μm直径的毛细管进行微量制备, 仍能达到良好的分离效果和重现性。

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